| 層流罩:潔凈區（室）沉降菌測定操作規程 | |||||
| 編號 | 頁???數 | 共頁 | |||
| 制定人 | 制定日期 | ???年 ??月? ?日 | 修訂日期 | ?年 ??月 ??日 | |
| 審核人 | 審核日期 | ?年? ?月 ??日 | 頒發部門 | ||
| 批準人 | 批準日期 | ?年? ?月 ??日 | 生效日期 | 年 ??月 ??日 | |
| 分發部門 | |||||
1.目的:明確潔凈區(室)沉降菌的質量控制標準，規范潔凈區(室)沉降菌的檢驗操作方法
2.適用范圍：潔凈區(室)沉降菌的控制和測試方法，及車間潔凈室和潔凈區無菌室或無菌區域（包括潔凈工作臺）的沉降菌的測定和環境的驗證。
3.責任者：質量控制部潔凈區(室)沉降菌檢驗操作人員車間QC檢驗操作人員。
4.操作內容和方法：
4.1.定義：
4.1.1菌落
4.1.1.1細菌培養后，由一個或幾個細菌繁殖而形成的一細菌集落，簡稱CFU，通常用個數表示。
4.1.1.2沉降菌
⑴ 用規定的方法收集到的活微生物粒子，通過專用的培養基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。
4.2.應對微生物進行動態監測，評估無菌生產的微生物狀況。
4.2.1監測方法有沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法（如棉簽擦拭法和接觸碟法）等。
4.2.2動態取樣應當避免對潔凈區造成不良影響。成品批記錄的審核應當包括環境監測的結果。
4.2.3對表面和操作人員的監測，應當在關鍵操作完成后進行。在正常的生產操作監測外，可在系統驗證、清潔或消毒等操作完成后增加微生物監測。
4.2.4潔凈區微生物監測的動態標準(1)如下：
| 潔凈度級別 | 浮游菌
cfu/m3 |
沉降菌（f90mm）
cfu /4小時(2) |
表面微生物 | |
| 接觸（f55mm）
cfu /碟 |
5指手套
cfu /手套 |
|||
| A級 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| B級 | 10 | 5 | 5 | 5 |
| C級 | 100 | 50 | 25 | － |
| D級 | 200 | 100 | 50 | － |
4.2.4.1表中各數值均為平均值。
4.2.4.2單個沉降碟的暴露時間可以少于4小時，同一位置可使用多個沉降碟連續進行監測并累積計數。
4.3.沉降菌測試操作方法：
4.3.1潔凈區沉降菌控制限度：
| 潔凈度級別 | 沉降菌/皿 | 測定頻次 | 潔凈度級別 | 沉降菌/皿 | 測定頻次 |
| A級 | ≤1 | 1次/日 | D級 | ≤100 | 1次/月 |
| C級 | ≤50 | 1次/周 |
4.3.2、測試操作方法：
4.3.2.1本測試方法采用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養平皿，經若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數，以平板培養皿中的菌落數來判定潔凈環境內的活微生物數，并以此來評定潔凈區的潔凈度。
4.3.2.2所用的儀器和設備
⑴ 高壓消毒鍋：使用時應嚴格按照儀器說明書操作。
⑵ 恒溫培養箱： 必須定期對培養箱的溫度計進行檢定。
⑶ 培養皿： 一般采用Ф90mm×15mm的硼硅酸玻璃培養皿。
⑷ 培養基：普通肉湯瓊脂培養基（微生物限度檢查法）或其他藥典認可的培養基。
4.3.3.測試操作步驟：
4.3.3.1采樣操作方法：將已制備好的培養皿按4.2.4.2的要求放置，打開培養皿蓋，使培養基表面暴露4h，再將培養皿蓋蓋上后倒置。
4.3.3.2培養。
⑴ 全部采樣結束后，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。
⑵ 在30℃–35℃培養箱中培養，時間不少于72h。
⑶ 每批培養基應有對照試驗，檢驗培養基本身是否污染?？擅颗x定3只培養皿作對照培養。
4.3.3.3菌落計數：
⑴ 用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點計，然后用5—10倍放大鏡檢查，有否遺漏。
⑵ 若培養皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數。
4.3.3.4.操作注意事項：
⑴ 測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
⑵ 采取一切措施防止人為對樣本的污染。
⑶ 對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。
⑷ 由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。
⑸ 采樣前應仔細檢查每個培養皿的質量，如發現變質、破損或污染的應剔除。
4.3.4.、測試操作規則。
4.3.4.1測試操作狀態。
⑴ 沉降菌測試前，被測試潔凈室的溫濕度須達到規定的要求，靜壓差、換氣次數、空氣流速必須控制在規定值內。
⑵ 沉降菌測試前，被測試潔凈室已經過消毒。
⑶ 測試狀態有靜態和動態兩種，測試狀態的選擇必須符合生產的要求，并在報告中注明測試狀態。
4.3.4.2測試人員
⑴ 測試人員必須穿戴符合環境潔凈級別的工作服。
⑵ 靜態測試時，室內測試人員不得多于二人。
4.3.4.3．測試時間：
⑴ 對單向流，如A級凈化房間及層流工作臺，測試應在凈化空調系統正常運行不少于10min后開始。
⑵ 對非單向流,如C級、D級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統正常運行不少于30min后開始。
4.3.4.4.沉降菌計數：
⑴ 采樣點數目及其布置。
⑵ 最少采樣點數目(沉降法的最少采樣點數可按表1確定)：。
表1????最少采樣點數目
| 面?積（M2） | 潔凈度級別 | |||||
| A級 | C級 | D級 | ||||
| 〈10 | 2-3 | 2 | 2 | |||
| ≥10－〈20 | 4 | 2 | 2 | |||
| ≥20－〈40 | 8 | 2 | 2 | |||
| ≥40－〈100 | 16 | 4 | 2 | |||
| ≥100－〈200 | 40 | 10 | 3 | |||
| ≥200－〈400 | 80 | 20 | 6 | |||
| ≥400－〈1000 | 160 | 40 | 13 | |||
| ≥1000－〈2000 | 400 | 100 | 32 | |||
| 2000 | 800 | 200 | 63 | |||
| 注：表中的面積，對于單向流潔凈室，是指送風面面積。對于非單向流潔凈室是指房間的面積。 | ||||||
⑶?在滿足最少測點數的同時，還應滿足最少培養皿數，見表2
表2???最少培養皿數
| 潔凈度級別 | 所需Ф90mm培養皿（以沉降4 h計） |
| A級 | 14 |
| C級 | 2 |
| D級 | 2 |
4.3.4.5.采樣點的布置。
⑴ 采樣點的位置可以同懸浮粒子測試點,采樣點的布置圖示如下：
A1潔凈棚（層流罩），潔凈工作臺等局部空氣凈化設施的采樣點布置：
A1.1?水平單向流
A1.2?垂直單向流
⑶ 可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加采樣點。
⑵ 工作區采樣點的位置離地0.8m—1.5m左右（略高于工作面）。
4.4、記錄
4.4.1測試報告中應記錄房間溫度、相對濕度、壓差及測試狀態。
4.4.2測試報告的編寫見標準的附錄
4.5、結果計算。
4.5.1用計數方法得出各個培養皿的菌落數。
4.5.2平均菌落數的計算，見式（1）
M1+M2+…Mn
平均菌落數M=──────……………（1）
n
式中：M—-平均菌落數，
M1—-1號培養皿菌落數，
M2—-2號培養皿菌落數，
Mn—-n號培養皿菌落數，
n—-培養皿總數。
4.6、結果評定:
4.6.1用平均菌落數判斷潔凈室空氣中的微生物;
4.6.1.1潔凈室內的平均菌落數必須低于所選定的評定標準。
4.6.1.2若某潔凈區內的平均菌落數超過評定標準，則必須對此區域先進行消毒，然后重新采樣兩次，測試結果均須合格。
